代謝π析（六）——NDSRI陽性對照怎么選？從“買不到”到“選得對”

引言

在前兩期文章中，我們系統探討了雙誘導倉鼠肝S9在亞硝胺類雜質遺傳毒性評估中的核心價值，以及NDMA、NDEA等小分子亞硝胺陽性對照的選擇策略。

然而，隨著ADC藥物、大分子藥物的快速發展，一類更復雜的亞硝胺雜質——NDSRI（原料藥相關亞硝胺雜質）正成為行業面臨的新挑戰。

這類雜質結構復雜、標準品難買、陽性對照不知如何選……本期「代謝π析」，我們就來拆解這個難題。

一、NDSRI是什么？為什么它讓行業“頭疼"？

在傳統的Ames試驗中，陽性對照通常選用2-氨基蒽（2-AA）、苯并[a]芘（BAP）等標準致突變物，用于驗證S9代謝活化系統的活性。然而，當評估亞硝胺類化合物時，情況發生了變化（詳見圖1）。

（圖1：NDMA/NDEA vs NDSRI 對比示意圖）

NDSRI，全稱Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities，即原料藥相關亞硝胺雜質。它與NDMA、NDEA等小分子亞硝胺有著本質區別[1][2] （詳見表1）：

（表1： 小分子亞硝胺vs NDSRI核心差異對比表）

核心痛點：NDSRI的陽性對照，不是“選哪個"的問題，而是“根本買不到"的問題。

二、監管機構怎么說？

FDA和EMA在最新指南中明確指出：對于NDSRI，由于缺乏化合物特異性數據，應基于結構相似的替代物（surrogate） 進行交叉參照評估。[1][2]

這意味著：您不需要為每一個NDSRI都合成專屬標準品（雖然這是優解），但必須能夠科學地論證：您選擇的替代物與目標NDSRI在結構上和代謝活化路徑上是相似的。

三、NDSRI陽性對照（替代物）的三大選擇標準

（圖2：NDSRI陽性對照選擇三大標準示意圖）

根據FDA指南和行業共識，選擇合適的替代物需滿足以下三個核心要素[5][6][9]：

標準1：結構相似性

替代物應與目標NDSRI具有相似的結構骨架和取代模式，尤其是亞硝胺官能團（N-N=O）周圍的化學環境。局部結構越相似，代謝活化路徑越可能一致。

標準2：有穩健的致癌性數據

替代物需有可靠的TD50值（來自嚙齒動物終生生物測定），這是計算AI限值的基礎數據。NDMA、NDEA、NDPA、NDBA、NNK等已知亞硝胺均有充分的數據庫支持。

標準3：相似的代謝活化路徑

替代物應能產生類似的重氮離子DNA反應活性。這意味著，替代物和目標NDSRI應被相似的CYP酶系（如CYP2E1、CYP2A6）代謝活化。

四、如何評估NDSRI的結構特征對致癌效力的影響？

在進行交叉參照時，需要評估NDSRI的結構特征會增強還是減弱其致癌效力[7]：

（表2：影響NDSRI致癌效力的結構特征）

實操提示：如果目標NDSRI含有多個“減弱效力"的特征，可以選擇一個效力稍高的替代物（如NDEA），這樣計算出的AI限值會更保守、更安全。

五、替代物選擇的分層策略

5.1 優選：結構最相似且有數據支撐的替代物

對于目標NDSRI，應優先尋找局部結構相似的已知亞硝胺作為替代物，重點關注亞硝胺官能團附近的化學環境。[5]

經典案例：N-亞硝基-去甲基氯吡拉明（一種NDSRI）通過交叉參照評估，選擇了4-（甲基亞硝胺基）-1-(3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）作為替代物。兩者在亞硝胺核心結構周圍的局部環境高度匹配，NNK具有穩健的致癌性數據（TD50=0.0999 mg/kg/day），據此可將AI從18 ng/day提升至100 ng/day。[8]

（圖3：NDSRI交叉參照案例示意圖）

5.2 次選：利用已知NDSRI標準品庫

目前，一些CRO/CDMO公司已建立了NDSRI對照品庫（如明捷醫藥、華測醫藥等）， 如果您評估的NDSRI恰好在這些庫中，可直接購買使用，這是省力的方案。

5.3 可選項：利用CPCA預測結合結構分類

FDA的CPCA方法根據亞硝胺的結構特征將NDSRI分為不同效力類別，并推薦對應的AI限值[3][4][10]（詳見表3）：

（表3：FDA  CPCA方法推薦的NDSRI效力分類與AI限值）

如果NDSRI的預測類別對應的AI可以接受，可能無需尋找替代物即可直接使用。

六、針對倉鼠S9用戶的實操建議

作為倉鼠S9試劑的用戶，您在不同場景下的陽性對照選擇方案（詳見表4）：

（表4：不同需求層級下的陽性對照選擇方案）

核心建議：

1. 絕大多數情況下，NDMA+NDEA作為基礎陽性對照是夠用的——它們足以驗證您的倉鼠S9批次對亞硝胺類雜質的代謝活化能力。

2. 如果客戶需要針對特定NDSRI進行方法驗證，建議采用“交叉參照"策略，根據目標NDSRI的結構特征選擇最相似的已知亞硝胺作為替代物。

3. 如果客戶面臨嚴格的監管審查，定制合成專屬NDSRI標準品是最穩妥的選擇。

七、NDSRI陽性對照選擇的決策流程圖

（圖4：NDSRI陽性對照選擇決策流程圖）

八、典型案例參考

案例背景：某ADC藥物研發企業，在其連接子工藝中發現了1個結構復雜的NDSRI雜質。該雜質含有芳香環等，商業標準品庫中無匹配項。[8]

解決方案：

1. 首先使用NDMA+NDEA驗證倉鼠S9批次的亞硝胺代謝活性（陽性對照響應正常）

2. 通過交叉參照分析，選擇NMBA（N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸）作為替代物——兩者均含有羧酸基團，代謝路徑相似

3. 利用NMBA的TD50數據計算AI限值，并采用含30%倉鼠S9的增強Ames試驗進行雜質致突變性評估

結果：該方案通過了監管機構的預審，企業避免了數十萬元的定制合成費用。

九、齊氏生物配套解決方案

齊氏生物不僅提供高品質的PB/BNF雙誘導倉鼠肝S9產品，同時為客戶提供加強Ames試驗配套試劑及技術咨詢服務：

結語

NDSRI的陽性對照選擇，確實比小分子亞硝胺復雜得多。但只要掌握了“交叉參照"的核心邏輯，結合CPCA預測和結構特征分析，您可以在不花大價錢定制合成的情況下，找到科學、合規的解決方案。

記住三個關鍵詞：結構相似、數據支撐、代謝匹配！

下一期「代謝π析」，我們將繼續探討倉鼠S9在更多藥物雜質評估場景中的應用，敬請期待！

參考文獻

[1] European Medicines Agency. Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products (EMA/409815/2020 Rev.21)[S]. 2024.

[2] U.S. Food & Drug Administration. Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs: Guidance for Industry[S]. 2024.

[3] U.S. Food & Drug Administration. Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities[S]. 2023.

[4] Schlingemann J, Burns MJ, Ponting DJ, et al. The landscape of potential small and drug substance related nitrosamines in pharmaceuticals[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2022, 112(5): 1287-1304.

[5] Nudelman R, Kocks G, Mouton B, et al. The nitrosamine “saga": lessons learned from five years of scrutiny[J]. Organic Process Research & Development, 2023, 27(10): 1719-1735.

[6] International Council for Harmonisation. ICH M7(R2): Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk[S]. 2023.

[7] Li Y, Hecht SS. Metabolic activation and DNA interactions of carcinogenic N-nitrosamines to which humans are commonly exposed[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(9): 4559.

[8] 陳某某, 等. 纈沙坦中亞硝胺藥物成分相關雜質(NDSRI)的(Q)SAR評價及Ames試驗研究[J]. 中國現代應用藥學, 2025.

[9] USP Nitrosamines Exchange. Enhanced Ames Test Conditions for N-nitrosamines (Q&A Rev.16)[EB/OL]. 2023. https://nitrosamines.usp.org/

[10] EFSA/WHO. Review of the Threshold of Toxicological Concern (TTC) approach and development of new TTC decision tree[R]. EFSA Supporting Publications, 2016.