代謝π析(五)——加強Ames試驗中，倉鼠S9對應的亞硝胺類陽性對照如何選擇？

引言

在上一期的文章中，我們深入探討了雙誘導倉鼠（金黃地鼠）肝S9在藥物毒理學研究中的核心價值，特別是其在亞硝胺類候選化合物遺傳毒性評估中的不可替代性。然而，一套高質量的代謝活化系統只是加強Ames試驗成功的一半。如何為亞硝胺類化合物選擇合適的陽性對照（Positive Control），同樣是確保試驗結果可靠、合規的關鍵環節。

本文將系統闡述加強Ames試驗（Enhanced Ames Test, EAT）中小分子亞硝胺類陽性對照的選擇原則，并提供基于最新研究數據和監管指南的實操建議。

一、為什么亞硝胺類需要“專門的"陽性對照？

在傳統的Ames試驗中，陽性對照通常選用2-氨基蒽（2-AA）、苯并[a]芘（BAP）等標準致突變物，用于驗證S9代謝活化系統的活性。然而，當評估亞硝胺類化合物時，情況發生了變化（詳見圖1）。

（圖1：亞硝胺類陽性對照在加強Ames試驗中的作用示意圖）

亞硝胺是一類前致突變物（pro-mutagen），需要在肝臟中被CYP450酶系（主要是CYP2E1和CYP2C19）代謝活化后才能產生致突變活性。傳統的陽性對照（如2-AA）雖然也能被S9活化，但其代謝途徑和酶譜需求與亞硝胺類存在顯著差異。使用與受試化合物代謝特征相匹配的陽性對照，才能更準確地驗證S9系統對亞硝胺類化合物的代謝活化能力。

EMA在關于亞硝胺雜質的指南中明確指出[7] ，加強Ames試驗應包含兩個亞硝胺類陽性對照，最好根據待測亞硝胺的預期代謝特征進行選擇。這標志著亞硝胺類陽性對照的選擇已經從“通用型"轉向了“靶向型"。

二、亞硝胺類陽性對照的推薦清單

綜合近年來多項關鍵研究數據（包括FDA優化研究、HESI國際合作環試研究以及2025年發表的綜述分析）[1][4]，以下化合物已被確認為適合在加強Ames試驗中作為陽性對照使用的亞硝胺類物質。

2.1 核心推薦：NDMA 和 NDEA

NDMA和N-亞硝基二乙胺（NDEA）是短鏈烷基亞硝胺中較具代表性的兩個成員，也是目前在加強Ames試驗中使用最為廣泛的陽性對照。

一項系統研究對NDMA和NDEA的Ames試驗檢測參數進行了定性與定量分析，發現兩者的致突變性可以在Ames試驗中輕松檢出，且最敏感的參數組合包括：30分鐘預孵育法、水或甲醇作為溶劑、誘導倉鼠肝S9，以及TA100、TA1535和WP2 uvrA(pKM101)菌株。[1]

值得注意的是，NDMA在不同菌株中表現出差異化的反應特征——在WP2 uvrA(pKM101)菌株中活性更高，而NDEA和CPNP則在TA1535和TA100菌株中更為活躍。[2] 因此，建議將NDMA和NDEA作為“菌株覆蓋型"陽性對照組合使用，以全面驗證不同突變檢測系統對亞硝胺類化合物的響應能力。[3]

2.2 擴展推薦：NDPA 和 NDBA

除了NDMA和NDEA之外，研究還發現N-亞硝基二丙胺（NDPA）和N-亞硝基二丁胺（NDBA）也是合適的亞硝胺類陽性對照選項。一項發表于2024年的比較研究明確指出，NDEA、NDPA和NDBA均可作為加強Ames試驗中額外的亞硝胺陽性對照使用。[1]

在實際應用中，使用10%誘導大鼠S9或10%誘導/未誘導倉鼠S9即可檢測到NDEA、NDPA和NDBA的致突變活性。這為實驗室在陽性對照選擇上提供了更大的靈活性。

三、陽性對照的選擇策略與濃度優化

3.1 基于待測化合物特征的分層選擇策略

建議采用以下分層策略來選擇陽性對照(詳見圖2和表3）

（圖2：亞硝胺類陽性對照分層選擇策略流程圖）

（表2：基于待測化合物特征的分層陽性對照選擇策略）

3.2 S9濃度對陽性對照響應的影響

S9濃度的選擇直接影響陽性對照的響應強度，進而影響試驗的有效性判定。多項研究得出一致結論：30%倉鼠S9產生的致突變響應高于10% S9。[1][4]

一項涵蓋29種亞硝胺和17種NDSRI的大規模優化研究顯示，使用TA1535和WP2 uvrA(pKM101)菌株組合、30分鐘預孵育、以及含30%倉鼠肝S9的S9混合液，即可檢測到全部18個陽性亞硝胺。[4]

對于NDMA，研究發現使用20%大鼠S9或10%倉鼠S9即可檢測到顯著突變頻率。但需要警惕的是，過高的S9濃度可能對細菌產生細胞毒性，導致突變頻率降低。研究建議將S9含量控制在10%即可獲得可靠結果，這同時符合3R原則。在實際操作中，建議采用雙濃度策略——使用10%和30%兩種S9濃度分別進行測試，以兼顧靈敏度與細胞毒性控制。[1]

四、陽性對照的濃度范圍與溶劑選擇

4.1 推薦濃度范圍

根據現有研究數據，亞硝胺類陽性對照在Ames試驗中的推薦濃度范圍如下（詳見表3），具體濃度需根據實驗室歷史數據和方法驗證結果進行微調[5] 。

（表3：亞硝胺類陽性對照在Ames試驗中的推薦濃度范圍）

4.2 溶劑選擇

溶劑的選擇對試驗結果有顯著影響（詳見表4），研究表明[5] ，N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）和乙酸乙酯等溶劑即使在較低劑量下也會抑制S9酶的活性。相比之下，二甲基亞砜（DMSO）在高達1.6%（v/v）的濃度下仍表現出良好的兼容性，且溶解能力強、細胞毒性低，因此被推薦為亞硝胺EAT的推薦溶劑。水也被證明是兼容的溶劑。 

（表4：亞硝胺類陽性對照在Ames試驗中的推薦溶劑與注意事項）

4.3 純度要求

為避免假陽性結果，所用陽性對照化合物應通過液相色譜-質譜聯用（LC-MS）確認高純度（>98%）。此外，研究中還可采用谷胱甘肽共孵育策略，以淬滅過量的烷化劑，確保檢測到的是真實的致突變信號而非非特異性烷化作用。

五、陽性對照在加強Ames試驗中的質量控制作用

加強Ames試驗與傳統Ames試驗在試驗設計上存在多個關鍵差異[6][8] （詳見表5） ：

（表5：傳統Ames試驗與加強Ames試驗（針對亞硝胺）的關鍵參數）

陽性對照在加強Ames試驗中承擔著以下關鍵質量控制功能[2] （詳見表6）：

（表5：傳統Ames試驗與加強Ames試驗（針對亞硝胺）的關鍵參數）

六、實操建議與常見問題

Q1：如何確認陽性對照試驗結果是有效的？

陽性對照組的回復突變菌落數應達到陰性對照組的3倍以上，且該效應應在多個劑量點呈現劑量-反應關系。同時，應建立實驗室內部的歷史數據范圍（均值±2SD），用于日常結果判定。

Q2：如果NDMA和NDEA的響應信號都很弱，可能是什么原因？

可能原因包括：（1）S9混合液中倉鼠S9濃度不足或批次活性較低；（2）預孵育時間不足（應確保30分鐘）；（3）溶劑對S9酶活性產生抑制；（4）陽性對照溶液配制有誤或已降解。建議首先使用10%和30%倉鼠S9進行平行測試以排查S9相關因素。

Q3：對于NDSRI類雜質，如何選擇合適的陽性對照？

對于NDSRI類雜質，EMA建議基于待測NDSRI的預期代謝特征來選擇陽性對照。如果缺乏直接匹配的陽性對照，可以組合使用NDMA/NDEA作為基礎陽性對照，同時選用一個結構相似、已知具有致突變活性的NDSRI作為補充陽性對照。

Q4：陽性對照的批次間差異如何處理？

建議每批新的陽性對照溶液與歷史批次進行平行測試，確保響應強度在歷史數據范圍內。陽性對照應分裝保存，避免反復凍融導致降解。

七、齊氏生物配套解決方案

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結語

在加強Ames試驗中，亞硝胺類陽性對照的選擇并非簡單的“拿來主義"。科學、合理的陽性對照選擇策略，是確保S9代謝活化系統有效性驗證準確性的基石，也是滿足EMA、ICH M7(R2)等監管要求的關鍵環節。

NDMA和NDEA作為經典的短鏈烷基亞硝胺陽性對照，是開展亞硝胺類雜質遺傳毒性評估的基礎選項；NDPA和NDBA可作為擴展選擇，提供更廣泛的代謝覆蓋。結合30%倉鼠肝S9、30分鐘預孵育以及TA1535/WP2 uvrA(pKM101)敏感菌株組合，可以較大化加強Ames試驗的檢測靈敏度。

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參考文獻

[1] Dieckhoff J, Bringezu F, Simon S. Metabolic activation of short-chain alkyl N-nitrosamines using Aroclor 1254 or phenobarbital/beta-naphthoflavone-induced rat or hamster S9 – A comparative analysis[J]. Toxicology Reports, 2024, 12: 215-223.

[2] Bringezu F, Simon S. Salmonella typhimurium TA100 and TA1535 and Escherichia coli WP2 uvrA are highly sensitive to detect the mutagenicity of short alkyl-N-nitrosamines in the bacterial reverse mutation test[J]. Toxicology Reports, 2022, 9: 250-255.

[3] Shukla RM, Valani DT, Kajavadara CK, et al. Comparative analysis of TA102 and WP2 uvrA(pKM101) strains in detecting nitrosamine mutagens in the enhanced Ames test[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2025, 66(5): 291-297.

[4] Bercu J, et al. HESI GTTC ring trial: Concordance between Ames and rodent carcinogenicity outcomes for N-nitrosamines (NAs) with rat and hamster metabolic conditions[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2025, 161: 105835.

[5] Kajavadara CK, Patel SN, Shukla RM, et al. Selection of solvent and positive control concentration for enhanced Ames test conditions for N-nitrosamine compounds[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2024, 152: 105711.

Kajavadara CK, Valani DT, Patel SN, et al. Strain-specific mutagenicity of NDMA and CPNP: insights from TA1535, TA100, and WP2 uvrA(pKM101) under metabolic activation[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2025, 117: 104752.

[7] European Medicines Agency. Enhanced Ames test conditions for N-nitrosamines; Appendix 3 to Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products (EMA/120337/2024)[S]. 2024.

[8] OECD. Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test (Ames test)[S]. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, 2020.

本期是「代謝π析·倉鼠S9專題」的第2篇，系統梳理了加強Ames試驗中NDMA、NDEA等小分子亞硝胺陽性對照的選擇策略。下一期我們將繼續深入探討一類更復雜的亞硝胺雜質——NDSRI（原料藥相關亞硝胺雜質），歡迎持續關注！